ТОЛСТАЯ КАПЛЯ

МУК 3.2.987-00

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

3.2. ПРОФИЛАКТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Паразитологическая диагностика малярии

Дата введения 2001-01-01

2. УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 19 октября 2000 г.

3. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.

Область применения и нормативные ссылки

1. Область применения и нормативные ссылки

Паразитологическую лабораторную диагностику малярии проводят клинико-диагностические лаборатории лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ) системы Минздрава, ведомственных учреждений, а также другие лаборатории, независимо от принадлежности и форм собственности (НИИ, вузов, Минобороны, УВД, частных клиник и т.д.), имеющие лицензию и аккредитованные в системе госстандарта и госсанэпиднадзора в установленном порядке.
Органы и учреждения государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации организуют и проводят эпидемиологический надзор за малярией, частью которого является:
контроль за уровнем лабораторной диагностики малярии в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений и других ведомств (в т.ч. исследования: 1) контрольные — не менее 10% препаратов крови, от числа отрицательных; 2) обязательные — 100% сомнительных и положительных препаратов крови с целью подтверждения лабораторного диагноза малярии);
обследование населения в очагах малярии, обследование населения по эпидпоказаниям и с консультативной целью.
В настоящих методических указаниях использованы ссылки на следующие нормативно-методические и правовые документы.
Федеральный закон «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» (30 марта 1999, N 52-ФЗ).
«Основы законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан» (22 июля 1993, N 5487-1).
Санитарные правила и нормы 3.2.569-96* «Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации».
_______________
* Действуют СанПиН 3.2.1333-03. — Примечание изготовителя базы данных.
Санитарные правила 3.1/3.2.558-96* «Общие требования по профилактике инфекционных и паразитарных заболеваний».
_______________
* Действуют СП 3.1/3.2.1379-03. — Примечание изготовителя базы данных.
Санитарные правила 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами 3-4 групп патогенности и гельминтами».

Общие положения

Возможность завоза малярии на территорию Российской Федерации, появление вторичных от завозных и местных случаев заболевания требуют своевременной лабораторной диагностики, необходимой для адекватного лечения и рационального проведения противоэпидемических мероприятий.
Малярию человека вызывают 4 вида паразитических простейших рода Plasmodium: Р. falciparum — возбудитель тропической малярии, Р. vivax — трехдневной малярии, Р. ovale — малярии типа трехдневной, Р. malariae — четырехдневной малярии. Неспецифические клинические проявления малярии, преимущественно в первые дни болезни, при наличии ряда объективных показателей эпидемиологического характера: географический анамнез (пребывание на территории стран с тропическим и субтропическим климатом) и клинического характера: лихорадочное состояние неясной этиологии, анемия, увеличение селезенки и ряд других — обязывают врачей лечебно-профилактических учреждений заподозрить малярию.
Безусловным подтверждением диагноза служит обнаружение малярийного паразита при микроскопическом исследовании крови. Особое значение имеет раннее выявление возбудителя тропической малярии, при несвоевременной диагностике которой возможен летальный исход. Определение вида паразита служит основанием для выбора рациональной терапии и правильной организации противоэпидемических мероприятий.

Периоды малярии

  • Инфицирование. Зараженный комар при укусе впрыскивает в кровь человека малярийные плазмодии
  • Инкубационный период малярии. Вид плазмодия обуславливает продолжительность периода — с момента заражения паразитами до первых симптомов
  • Продромальный период — начало предвестников болезни, симптомы неспецифичные и обусловлены общей реакций организма на внедрение чужеродного агента. Присуще — небольшая температура, ломота в костях, слабость, чувство усталости, тошнота с головокружением
  • В фазе эритроцитарной шизогонии обнаруживаются признаки малярии. Пароксизмы лихорадки появляются, при содержании паразитов в крови выше пирогенного уровня — определенного количество паразитов в 1 мкл крови. Включаются механизмы клеточного и гуморального иммунитета — это способствует убавлению паразитемии, стиханию процесса и ренегерации структурных и функциональных поражений органов и тканей.

Симптоматика различна в зависимости от фазы

  • Первая фаза — сильный озноб, пульс учащен, дыхание неглубокое, конечности холодные
  • Вторая фаза — температура подскакивает до критической отметки в 40-41 градус, лицо гиперемировано, склеры иньецированы, кожа горячая, сухая. Психомоторные реакции неадекватны: возбуждение, беспокойство, бред. Часто присоединяются клинические судороги
  • Третья фаза — отмечается обильное потоотделение, жар спадает.

Общая продолжительность всех трех фаз 6-10 часов. Ослабленный больной погружается в сон.

Создается ложное впечатление, что малярия вроде отступает, характерные симптомы проходят, больной испытывает сильное изнурение.

Развивающаяся гемолитическая анемия является следствием массивного разрушения эритроцитов.

На начальных стадиях болезни цикличность приступов не соблюдается, потому что в разные сроки развиваются выводки паразита, но по мере прогрессирования заболевания выводки синхронизируются и наступает классическая картина малярии.

Симптомы общие для всех видов: лихорадка, гепатоспленомегалия, гемолитическая анемия.

Различие

При трехдневной малярии — инкубация 10-20 дней. При заражении гипнозоитами от 6 месяцев и более. Приступы строго цикличны, развиваются до полудня. Возможны рецидивы. Длится болезнь 2-3 года.

Малярия овале напоминает малярию трехдневную, но с более благоприятным протеканием. Приступы, большей частью, по вечерам. Бывают рецидивы. Длительность 3-4 года.

Четырехдневная малярия отличается самым доброкачественным течением. При ней отмечается низкая паразитемия. Эритроцитарная шизогония замедлена и длится годами. Из-за этого продолжительность заболевания до 4, иногда 50 лет.

Самое неблагоприятное течение у тропической малярии. Возникает полиорганная недостаточность: отек легких, генерализованные судороги, острая почечная недостаточность, циркуляторный коллапс, сопровождаемый комой и смертью.

Малярия у беременной женщины

Малярия во время беременности связана с существенными рисками для самой женщины, плода и ребенка. Симптомы и осложнения во время беременности варьируются от уровня заболеваемости в данной географической зоне и уровня приобретенного иммунитета.

В эндемичных районах уровень иммунитета высокий, и при заражении у женщины симптомы могут не проявляться, тем не менее паразиты присутствуют в плаценте и вызывают у беременной анемию. Это приводит к гипотрофии плода и детской смертности.

В областях с низким уровнем заболеваемости малярией при отсутствии у беременной женщины защитных антител, заболевание протекает тяжело и часто приводит к самопроизвольным абортам, мертворождениям, преждевременным родам.

Малярия приводит к материнской смертности от осложнений: почечная недостаточность, кровотечения, ДВС-синдром.

Малярия у детей

В регионах с широкой распространенностью малярии ребенок получает от матери пассивный иммунитет к болезни, который сохраняется у него 6-9 месяцев.

Малярия у детей до года имеет отклонения от обычного течения: озноб и лихорадка отсутствуют, вместо озноба — похолодание и цианоз конечностей. В фебрильную фазу появляются судороги и менингоэнцефалитические явления. Диспепсия: срыгивания, рвота, метеоризм, поносы. Нарушение сна, аппетита, поведенческих реакций.

У детей старше 5 лет наблюдаются. как правило, типичные приступы малярии.

У детей очень быстро развивается «церебральная» малярия при поражении центральной нервной системы: менингизм, делирий и кома, приводящая к смерти. Осложнения — поражение печени, почек, нервной системы.

Рецидивы

Симптомы малярии могут возвращаться после затихания.

Повторный возврат — симптомы возвращаются после бессимптомного периода. Это вызвано паразитами, выжившими в крови в результате неадекватного или неэффективного лечения.

Рецидив — симптомы появляются вновь после удаления паразитов из крови, но сохраняющихся в спящих гипнозоитах в клетках печени. Рецидив происходит между 8-24 неделями при малярии овале и трехдневной малярии.

Реинфекция происходит тогда, когда организм в результате лечения избавился от паразита, вызвавшего инфекцию в прошлом, но произошло заражение вновь.

По версии ВОЗ критерием тяжелой малярии является один из этих признаков

  • Нарушение сознания вплоть до малярийной комы
  • Сильная слабость
  • Более 2 эпизодов судорог
  • Низкое артериальное давление (у взрослых ниже 70 мм ртутного столба, у детей — ниже 50 мм)
  • Геморрагический шок
  • Почечная недостаточность
  • Кровотечения на фоне ДВС-синдрома или гемолитическая анемия при Hb ниже 50 г/л
  • Отек легких
  • Уровень глюкозы ниже 2,2 ммоль/л
  • Невозможность усвоения пищи (неукротимая рвота)
  • Уровень ацидоза более 5 ммоль/л
  • Уровень паразита в крови, превышающий 100 000 мкл в областях с низкой интенсивностью передачи, или 250 000 мкл в областях с высокой интенсивностью передачи.

Лабораторная диагностика малярии

Диагноз достаточно сложно поставить, если это единичный случай завозной инфекции. Предположение должно возникнуть при наличии у пациента: лихорадки неясной этиологии, выезда в эндемичные страны, переливания крови, наркотической зависимости. Окончательный диагноз основывается на лабораторных данных — нахождения в крови пациента какого-либо вида плазмодия.

  • Анализ крови. Уровни эритроцитов, гемоглобина снижены. Цветной показатель низкий. Лейкоцитоз, тромбоцитоцитоз.
  • Анализ мочи. Гематурия, гемоглобинурия, эритроцитурия.
  • Биохимия крови. Диспротеинемия. АЛТ, АСТ, билирубин — увеличены.

У 95% людей, инфицированных малярией, первые проявления болезни появляются через 4-6 недель, но у некоторых время мнимого благополучия растягивается до года после заражения.

Характеристика развития малярийного паразита в эритроцитах

Проявления малярии обусловлены развитием паразита в эритроците — так называемой эритроцитарной шизогонией. В процессе эритроцитарной шизогонии образуются бесполые и половые формы паразита.
Бесполые формы за период времени, характерный для каждого вида паразита, проходят в эритроцитах ряд последовательных возрастных стадий своего развития, строение которых (морфология) и их окрашиваемость (тинкториальные свойства) хорошо различимы в «тонком мазке» крови. Трофозоиты — одноядерные растущие стадии: кольцевидные, развивающиеся (амебовидные, полувзрослые) и зрелые. Шизонты — делящиеся стадии: развивающиеся (незрелые), с последовательным делением ядер и общей цитоплазмой и зрелые, представляющие скопление дочерних клеток мерозоитов с обособленными ядрами и цитоплазмой. В динамике эритроцитарная шизогония в общем виде протекает следующим образом. Мерозоит, внедрившийся в эритроцит, быстро увеличивается в размере, в цитоплазме появляется пищеварительная вакуоль и образуется — кольцевидный трофозоит. На этой стадии цитоплазма имеет вид узкого ободка, огибающего пищеварительную вакуоль, ядро сравнительно мелкое, компактное с трудно различимой структурой хроматина, оттеснено к одному из полюсов клетки. По мере роста паразита увеличиваются его размеры, количество цитоплазмы нарастает: ядро становится более крупным, менее компактным. В цитоплазме могут появиться асимметричные утолщения, различающиеся по форме и числу, псевдоподии — образуется амебовидный трофозоит. В дальнейшем у развивающегося трофозоита постепенно исчезает вакуоль, продолжает увеличиваться ядро и количество цитоплазмы — образуется зрелый трофозоит. Зрелый трофозоит — округлая или несколько вытянутая клетка с относительно рыхлым ядром, правильной или несколько вытянутой формы, занимающая весь или часть пораженного эритроцита. Затем наступает стадия шизонта, начинается попарное деление ядер, образуется развивающийся (незрелый) шизонт. По окончании деления ядер одномоментно делится цитоплазма, обособляясь вокруг каждого из дочерних ядер — образуется зрелый шизонт, состоящий из мерозоитов; их число, размеры и расположение по отношению к скоплению пигмента характерны для каждого вида плазмодиев (см. таблицы). При отсутствии или неэффективном лечении мерозоиты внедряются в интактные эритроциты, и цикл вновь повторяется с присущей для каждого вида плазмодиев продолжительностью развития одной генерации. У Р. falciparum, P. vivax, P. ovale — 48 ч, Р. malariae — 72 ч.
В процессе роста паразита в его цитоплазме появляется малярийный пигмент — продукт метаболизма гемоглобина, представляющий собой включения от едва заметных мелких зерен и гранул до относительно более крупных, неправильной формы, от золотисто-коричневого до черного цвета. Количество пигмента, размеры его частиц и распределение в цитоплазме паразита меняются по мере его перехода в последовательные стадии развития.
У части трофозоитов деления ядер не происходит и они дифференцируются в половые формы, гаметоциты — женские (макрогаметоциты) и мужские (микрогаметоциты). Мужские и женские гаметоциты различаются между собой по морфологии, в первую очередь по структуре ядра, характеру и окраске цитоплазмы. В отличие от бесполых форм гаметоциты не имеют выраженной вакуоли, характеризуются значительно более обильным и грубым пигментом. Округлая форма присуща гаметоцитам Р. vivax, Р. ovale и Р. malariae, удлиненная серповидная (полулуния) — Р. falciparum. Гаметоцитов образуется меньше, чем бесполых форм. При этом женских гаметоцитов в 3-5 раз больше, чем мужских, что затрудняет выявление последних. Гаметоциты Р. vivax, Р. ovale, P. malariae значительно отличаются от гаметоцитов Р. falciparum по срокам созревания, появления в периферической крови и сохранения способности заражать переносчика (самок комара Р. anopheles).

Р. vivax, Р. ovale и Р. malariae развиваются в эритроцитах, циркулирующих в периферической крови. Развитие Р. falciparum происходит в синусах селезенки и мелких капиллярах внутренних органов в связи с адгезией пораженных эритроцитов к стенкам таких капилляров. В периферической крови обнаруживаются, преимущественно при неосложненном течении, только самые молодые стадии — кольцевидные трофозоиты. Их число очень быстро нарастает, поэтому при однократном исследовании периферической крови в начале болезни можно получить неправильное представление об истинном числе паразитов. При осложненном течении в периферической крови могут быть обнаружены более зрелые возрастные стадии паразита и гаметоциты в связи с нарушением сосудистого тонуса.
При оценке результатов исследования препаратов крови, наряду с типичной морфологией возбудителя, необходимо учитывать ряд особенностей, характеризующих паразитологическое развитие инфекции собственно и привходящих воздействий (предшествовавшее применение противомалярийных препаратов, неправильное приготовление и окраска препаратов крови).

Лечение

Все лица с подозрением на малярию подлежат обязательной госпитализации в стационары со строгим постельным режимом. При подтверждения диагноза начинают терапию антипротозойными препаратами.

1 этап — медикаментозное этиотропное лечение, то есть лечение, направленное на уничтожение малярийного плазмодия.

2 этап — патогенетическая терапия, призванная купировать те или иные симптомы, появляющиеся в ходе патогенного действия паразита на организм.

При необходимости — реанимационные мероприятия, очищение крови методом гемосорбции и гемодиализа.

В состав этиотропной терапии входят антипаразитарные препараты, действие которых проявляется в отношении плазмодий, находящихся на стадии эритроцитарной шизогонии, и на гаметоциты.

  • Хинолины — препараты из коры хинного дерева: хинин и его аналоги самый первый и единственный до 1940-х годов противомалярийный препарат. Синтетические препараты: хлорохин, амодиахин — самые безопасные и наиболее эффективные.
  • Мефлохин, галофантрин применяются для лечения видов паразита, устойчивых к хлорохину. Недостатки: сильное побочное действие, преимущественно, у детей и беременных женщин.
  • Артезимиды. Синтетические формы — артеметер, артетер. Быстродействующие против гаметоцитов. Комбинируются с другими лекарствами для повышения эффективности и уменьшения вероятности возникновения резистентности к противопаразитарным препаратам. Недостатки — дорогостоящие и сложные для применения схемы лечения.
  • Антифолаты. Синтезированы в виде сульфадоксина и пириметамина. Используются в комбинации, так как обладают синергическим действием и уменьшают развитие резистентности. Недостатки — быстрое развитие устойчивости и сильные побочные действия.
  • Антибиотики. Тетрациклин, доксициклин чаще всего применяют вместе с противопаразитарными лекарствами для усиления их действия.

Уход за больным

Важнейшим условием эффективности проводимых лечебных мероприятий является уход за больными. Малярия настолько тяжелое и коварное заболевание, что необходим постоянный мониторинг состояния заболевшего. Во время приступа при появлении озноба больного укрывают, допустимо согревание грелками. При подъеме температуры раскрыть больного. к голове приложить пузырь со льдом. После обильного потоотделения, больного переодеть в сухое белье и обеспечить полный покой.

Между приступами при удовлетворительном состоянии пациента особой диеты не предусматривается — общий стол №15 и обильное питье. Во время приступа — стол №13. Цель этой диеты — поддержание сил организма и щажение органов пищеварения. Диета пониженной калорийности, содержит легкоперевариваемые продукты, без грубой клетчатки.Еду готовят на пару, варят. Пищу употребляют в протертом виде, теплую, дробно, маленькими порциями

Иммунитет

Малярия является древнейшей болезнью на Земле и за долгую борьбу с ней человеческий организм вырабатывал пути защиты. У коренного населения, проживающего в эндемичных по малярии районах, обнаружены генетически детерминированные изменения эритроцитов. Серповидно-клеточная анемия, дефицит некоторых ферментов, антиген Даффи. Дефект строения красных кровяных телец при серповидно-клеточной анемии приводит к быстрому их выводу из кровобращения и малярийный плазмодий не успевает завершить цикл развития.

Антиген Даффи (по имени больного, у которого он был обнаружен) — белок, расположенный на поверхности эритроцитов и являющийся рецептором для малярийных паразитов. В случае отсутствия этого белка, человек не заболевает малярией P.vivax.

В малярийных районах, как распространенность, так и тяжесть малярии снижаются с возрастом. После заболевания малярией не вырабатывается длительный иммунитет. Все взрослые в эндемичных районах подвергаются повторным заражениям. Предполагается, что при многократных воздействиях на организм малярийного плазмодия, вырабатываются антитела против них и это снижает восприимчивость к инфекции (активный иммунитет). Но защита эта нестойкая и длится 6-9 месяцев. Пассивный иммунитет, передаваемый матерью своему ребенку также сохраняется не более полугода.

Профилактика

Для стран с высоким уровнем заболеваемости

  • Ранняя диагностика
  • меры индивидуальной защиты от укусов (репеленты)
  • Противокомариные сетки, экраны
  • Профилактическая химиотерапия противопаразитарными препаратами включает профилактическое лечение беременных женщин, детей, для предотвращения заболевания малярией
  • Ликвидация мест выплода комариных личинок: осушение болот, мелиорация, обработка мест возможного скопления насекомых инсектицидами.

Профилактические меры для путешественников, собирающимся посетить регионы эндемичные по заболеваемости малярией

  • Ношение закрытой одежды
  • Использование репелентов против насекомых
  • Защита помещения от проникновения комаров москитными сетками, экранами
  • Обработка открытых участков тела репелентами
  • Прием антималярийных лекарств по специальной схеме: до поездки, во время и после возвращения домой предотвратит заражение. Рекомендуемые препараты: хлорохин, доксициклин, мефлохин.

Настороженность в отношении малярии должна присутствовать не менее 3 лет после путешествия. Необходимо знать основные симптомы малярии, чтобы в случае их появления немедленно обратиться за медицинской помощью.

В настоящее время вакцины против малярии не существует, хотя в разработке задействованы крупные научные центры, учитывая опасность этой болезни и большой процент смертных случаев, особенно у детей.

Чтобы существенно сократить заболеваемость малярией необходимы комплексные меры, включающие медицинские мероприятия (диагностика, лечение), государственные программы, нацеленные на улучшение условий проживания коренного населения (комфортное жилье, средства на приобретения индивидуальных средств защиты, доступность получения медицинской помощи) и борьба с переносчиком, чтобы блокировать пути передачи инфекции.

Принцип метода паразитологической диагностики малярии

Паразитологическая диагностика малярии основана на обнаружении бесполых и половых форм возбудителя при микроскопическом исследовании крови, что возможно только в период его развития в эритроците. Для обнаружения плазмодиев и определения их вида используют препараты крови, приготовленные методом «тонкого мазка» и «толстой капли», окрашенные по Романовскому-Гимза. Оба метода, имеющие свои преимущества и недостатки, являются взаимодополняющими.
Основной метод — «толстая капля». Благодаря распределению относительно большего объема крови на меньшей площади, за один и тот же промежуток времени просматривается количество крови в 30-40 раз большее, чем в «тонком мазке», что значительно повышает шанс обнаружения паразитов, особенно при низкой паразитемии. Начинать надо всегда с просмотра «толстой капли».
Чувствительность метода «толстой капли» такова, что при просмотре 100-150 полей зрения можно обнаружить около 8 паразитов в 1 мкл крови. Концентрация исследуемой крови на ограниченной площади приводит к многослойному расположению эритроцитов. Для того чтобы паразиты были видимы, «толстую каплю» окрашивают нефиксированной; это приводит к гемолизу эритроцитов, и паразиты подвергаются деформации. Несмотря на определенную специфичность, такая деформация иногда может препятствовать идентификации вида паразита. Ограничиться просмотром «толстой капли» можно только, если вид паразита был первоначально установлен. «Толстая капля» относительно быстро позволяет выявить и других паразитов крови: трипаносом, микрофилярий, спирохет, бабезий и др. Отрицательный паразитологический результат изучения «толстой капли», но повышенное содержание остатков незрелых эритроцитов позволяет предположить перенесенную недавно малярию (при отсутствии соответствующих анамнестических данных), обнаружение повышенного содержания лейкоцитов, их видовой состав, а также повышенное содержание остатков незрелых эритроцитов, позволяют предположить иное заболевание, не связанное с малярией.
В «тонком мазке», фиксированном до окраски, сохраняются морфологические особенности как пораженного эритроцита, так и присущие данному виду паразита. Большое значение для дифференциального диагноза имеет характер изменения пораженных эритроцитов. «Тонкий мазок» крови делают в дополнение к «толстой капле». В тех случаях, когда вид возбудителя в очаге установлен, для эпиднадзора за очагом можно ограничиться методом «толстой капли».

Необходимые реактивы и оборудование

1. Этиловый спирт 96°.

2. Азур-эозин по Романовскому-Гимза (промышленный маточный раствор или сухая краска).

3. Метиленовый синий.

4. Этиловый эфир.

5. Глицерин.

6. Тетраборат натрия (бура).

7. Калий фосфат однозамещенный безводный — KHPO.

8. Натрий фосфат двузамещенный безводный — NaHPO.

9. Смесь Никифорова (смесь этилового спирта и эфира в равных частях).

10. Дистиллированная вода.

11. Индикаторная бумага (диапазон рН 5,0-8,0).

12. Фильтровальная бумага.

13. Химическая посуда: мерные цилиндры или стаканы на 10, 50 и 100 мл; градуированные центрифужные пробирки; колбы и стаканы; стеклянные палочки.

14. Предметные стекла

15. Шлифованные стекла.

16. Фарфоровая ступка с пестиком.

17. Аптечные равноплечие или электронные весы.

18. Эмалированные кюветы.

19. Пинцеты.

20. Часы песочные или сигнальные.

21. Стеклянные мостики или специальные контейнеры для окрашивания препаратов крови.

22. Скарификаторы стерильные одноразовые.

23. Бинты стерильные, вата.

24. Перчатки резиновые.

25. Микроскоп с осветителем (объективом х90 или х100, окуляром х7; х10).

26. Термостат.

27. Холодильник.

Техника паразитологической диагностики

6.1. Подготовка предметных стекол

1. Предметные стекла новые замачивают в мыльном растворе, нагревают до 60-80 °С, но не кипятят.

2. Каждое предметное стекло протирают ветошью с обеих сторон в этом растворе.

3. Промывают в проточной воде в течение 2-3 ч, периодически перемешивая.

4. Погружают в дистиллированную воду на 30 мин.

5. Проверяется качество отмывки предметных стекол от щелочи: на предметное стекло наносят 1 каплю фенолфталеина — появление розовой окраски раствора свидетельствует о недостаточной отмывке от щелочи.

6. Стекла протирают чистой хлопчатобумажной тканью и помещают для обезжиривания в смесь Никифорова (из расчета 1 мл смеси на 1 стекло), где они могут храниться в течение длительного времени.

7. Извлеченные пинцетом из смеси Никифорова стекла протирают хлопчатобумажной стираной материей, заворачивают в чистую гладкую не ворсистую (!) бумагу небольшими партиями и стерилизуют.
Стекла, многократно бывшие в употреблении, для приготовления препаратов крови использовать не рекомендуется. При необходимости их использования, следует удалить следы иммерсионного масла простиранной ветошью, затем отмыть каждое стекло от окрашенных препаратов крови в теплом мыльном растворе (для этой цели удобно использовать зубную щетку с коротко срезанной щетиной). Дальнейшая обработка — такая же, как и новых стекол.

Во время манипуляций с чистыми предметными стеклами их следует брать только за боковые поверхности или пинцетом.

6.2. Приготовление и хранение реактивов

6.2.1. Раствор краски Романовского-Гимза

Маточный раствор краски Романовского-Гимза (промышленный или приготовленный из сухой субстанции) представляет собой густую темно-фиолетовую жидкость, которую можно хранить длительное время в хорошо закупоренных бутылях из темного стекла в сухом защищенном от света прохладном месте (но не в холодильнике). Для текущей работы перед приготовлением рабочего раствора краски Романовского-Гимза необходимое количество маточного раствора краски, отливают в небольшой флакон, обязательно фильтруя, т.к. при хранении маточного раствора может выпасть осадок. Краску следует набирать сухой пипеткой или отливать через горлышко. Для определения качества краски рабочим раствором каждой новой серии производят пробное окрашивание мазков крови.
Для приготовления маточного раствора из сухой краски Романовского-Гимза необходимы следующие реактивы:
азур-эозин — 10 г;
глицерин — 100 мл;
спирт этиловый 96° — 900 мл.
Техника приготовления краски предусматривает следующие этапы:

1. Азур-эозин тщательно растирают в фарфоровой ступке с небольшим количеством спирта и глицерина до получения кашицеобразной массы и сливают в колбу или бутыль из темного стекла. Затем постепенно добавляют остальной спирт и глицерин.

2. Полученную взвесь тщательно встряхивают в течение 10 мин 2-3 раза.

3. Емкость с краской помещают в термостат при температуре 37° на 3-5 дней для созревания краски с ежедневным встряхиванием этой емкости вручную не менее 10 мин. При наличии магнитной мешалки встряхивание можно продолжать несколько часов. При наличии подогревателя в мешалке взвесь можно подогревать, при этом подогрев не должен превышать 40-50°, периодически подогреватель следует выключать с тем, чтобы температура не повышалась выше указанного уровня. Встряхивание и подогрев улучшают качество краски.
После каждого встряхивания раствор снова помещают в термостат.

4. Через 3-5 дней готовый раствор краски фильтруют через бумажный фильтр.

6.2.2. Буферный раствор

Необходимые реактивы:

1. Дистиллированная вода — 1 л.

2. Фосфат калия однозамещенный безводный — KHPO — 0,27 г.

3. Фосфат натрия двузамещенный безводный — NaHPO — 0,67 г.
Техника приготовления:

1. Соли растворить в дистиллированной воде (1/3 объема) комнатной температуры, после полного растворения довести до метки 1000 мл и размешать.

2. Приготовленный раствор должен иметь рН 7,0±0,2. Точное соблюдение требуемой реакции буфера важно для правильной окраски. Если рН<6,8, то следует добавить NaHPO, если рН>7,2, то добавляется KHPO. Количество реактивов, необходимых для доведения рН, подбирается опытным путем.
Буферный раствор следует хранить в хорошо закупоренной посуде в холодильнике (до 1 месяца). Для приготовления краски используется буферный раствор комнатной температуры. Нельзя использовать буферный раствор с осадком, который после окраски затрудняет просмотр препарата и даже может привести к диагностическим ошибкам. Периодически следует проверять рН буферного раствора, особенно при искажении цвета окрашенных элементов крови.

6.3. Взятие проб крови для исследования на малярию

1. Кровь для паразитологического исследования берут из пальца руки (у взрослых — обычно безымянного, у детей — из большого), у новорожденных детей — из большого пальца ноги (но не мочки уха).

2. Периферическую кровь для исследования берут вне зависимости от температуры тела и клинических проявлений.

3. Для прокола кожи пальца используют стерильные одноразовые скарификаторы или специальные стерильные разового использования иглы.

4. В целях безопасности пациента взятие крови на малярию производят на стерильные предметные стекла, т.к. во время взятия крови возможно их касание к месту прокола.

5. Перед проколом кожу пальца тщательно протирают ватным тампоном, смоченным в 70%-ном спирте, чем достигается не только предупреждение инфицирования места прокола, но и попадание с кожи пальца бактерий, различных посторонних частиц на препарат крови, которые могут затруднить диагностику при микроскопии.

6. Первую каплю крови, выступившую после прокола, вытирают сухим стерильным ватным тампоном, чтобы избежать фиксации эритроцитов остатками спирта, которым дезинфицировали кожу.

7. Последующие капли (выступающие самостоятельно или при надавливании на палец массирующими движениями) используются для приготовления препаратов крови. При этом кровь забирают в стерильный сухой гематологический капилляр, из которого быстро переносят на предметное стекло, либо выступившую кровь непосредственно из прокола пальца наносят на предметные стекла. Если кровь набирают в капилляр, то можно использовать не стерильные стекла, но подготовленные так же, как описано в п.6.1.

8. От одного пациента готовят не менее 2-3 стекол с «толстыми каплями» и 2-3 «тонких мазка» крови. Рекомендуется первоначально окрасить по одному стеклу, с тем чтобы иметь возможность исправить дефекты окраски.

При косвенных показаниях (анамнестических, эпидемиологических, клинических) о наличии малярии у обследуемого, но отрицательном первичном результате, кровь исследуют повторно через каждые 6-12 часов в течение 2-х суток.

6.4. Приготовление препаратов крови, их маркировка и фиксация

6.4.1. Препарат «толстая капля»

1. Препарат «толстая капля» на предметном стекле без мазка (рис.1):
на предметное стекло наносят каплю крови диаметром около 5 мм, кровь распределяют в равномерный диск или прямоугольник размером 1-1,5 см.
на краю стекла делается мазок в виде полоски крови для маркировки препарата, при массовых обследованиях делаются две полоски, где наносят маркировку.

Рис.1. «Толстые капли» на предметном стекле без мазка

Рис.1. «Толстые капли» на предметном стекле без мазка

2. Препарат «толстая капля» на мазке (рис.2):
на предметном стекле готовят мазок крови более толстый, чем требуемый для исследования на малярию;
сразу после приготовления мазка, пока мазок не высох, его влажной поверхностью прикасаются к выступившей капле крови или наносят кровь из капилляра;
кровь на влажном мазке распределится в равномерный диск при осторожных наклонах предметного стекла под небольшим углом в разные стороны; чем больше взятая капля крови, тем больше площадь, по которой она распределится.

Рис.2. «Толстые капли» на мазке

Рис.2. «Толстые капли» на мазке

Капля крови, нанесенная на мазок, более прочно прикрепляется, чем нанесенная непосредственно на предметное стекло. Толщина «толстой капли» должна быть такой, чтобы через нее просматривался печатный текст. Слишком толстая капля может оторваться от стекла при высушивании; такой препарат непригоден для исследования.
Независимо от методики приготовления показателем достаточного содержания крови в «толстой капле» является обнаружение в 1 поле зрения микроскопа в среднем 10-15 лейкоцитов (увеличение: объектив х90-100, окуляр х7).

3. Комбинированные препараты (рис.3).

Рис.3. Комбинированное приготовление препаратов крови

Рис.3. Комбинированное приготовление препаратов крови

В целях экономии стекол, особенно при массовых обследованиях, на предметном стекле одновременно готовят «тонкий мазок» и «толстую каплю».
Этот метод, однако, требует ряда предосторожностей. Для того чтобы оба препарата были пригодны для исследования, необходима четкая последовательность их обработки. Необходимо начинать с окраски «толстой капли» погружением соответствующего участка предметного стекла в раствор краски. Затем фиксируют «тонкий мазок» и окрашивают его. Нельзя начинать с фиксации «тонкого мазка», т.к. даже при очень аккуратном погружении в фиксирующую жидкость участка предметного стекла, на который нанесен «тонкий мазок», в «толстой капле» эритроциты могут подвергнуться фиксации парами фиксатора. При последующей окраске такая капля станет непригодной для исследования, даже если фиксация была неполной.
Все препараты высушивают на воздухе. Для ускорения высыхания «толстых капель» можно использовать обычный комнатный вентилятор.

Высушивание на солнце, огне или любом другом источнике тепла исключается, так как препарат становится непригодным для исследования.

Особенно это относится к «толстой капле», которая под действием тепла подвергается аутофиксации и необходимый гемолиз при окраске не наступает. «Толстые капли» (особенно в процессе высыхания) и фиксированные «тонкие мазки» следует беречь от тараканов, мух и муравьев, съедающих кровь.

6.4.2. Препарат «тонкий мазок » (рис.4)

Рис.4. «Тонкий мазок» крови

Рис.4. «Тонкий мазок» крови

2. Предметное стекло с нанесенной каплей кладут на горизонтальную поверхность стола, при этом край стекла с каплей крови должен быть справа*.

3. Двумя пальцами левой* руки предметное стекло за боковые поверхности фиксируется на столе.

4. Край шлифованного стекла (фиксированного в правой* руке) ставится под углом 45° к предметному стеклу, прикасаясь к левому* краю капли крови.

5. После того как капля растекается по касательной линии в месте соприкосновения обоих стекол, шлифованное стекло быстрым движением продвигают справа налево* к противоположному краю предметного стекла, постепенно ослабляя давление на предметное стекло, что позволяет закончить «тонкий мазок» бахромчатой частью, где наиболее четко видны специфические особенности морфологии паразитов и изменения пораженных эритроцитов. Мазок крови должен быть тонким, равномерным, не доходить до конца и краев предметного стекла, заканчиваться бахромчатым краем (рис.4).
________________
* Для лаборанта левши читать вместо левого положения — правое, вместо правого — левое.
Если угол наклона шлифованного стекла увеличить, то мазок получится короткий и толстый, с расположением эритроцитов в несколько слоев (это маскирует некоторых паразитов, а также приводит к их деформации); если уменьшить угол наклона, то трудно создать бахромчатую часть мазка. Качество «тонкого мазка» зависит также от правильной подготовки предметного стекла и равномерности края шлифованного стекла.
На плохо вымытом жирном стекле и при дефектах на краю шлифованного стекла «тонкий мазок» получается неравномерным и с просветами. Возможные дефекты тонких мазков показаны на рис.5.

Рис.5. Дефекты приготовления «тонких мазков»

Рис.5. Дефекты приготовления «тонких мазков»

6.4.3. Маркировка препаратов крови

1. Высохшие препараты крови маркируют простым карандашом (он не смывается во время фиксации и окрашивания).

2. Маркировка включает фамилию и инициалы или номер истории болезни (можно номер страхового полиса), или порядковый номер по списку обследуемого и, обязательно, дату взятия крови.

3. Препарат «толстая капля», приготовленный непосредственно на предметном стекле, маркируют на полоске крови.

4. Препарат «толстая капля» на подкладке маркируют по мазку, не задевая каплю.
5. «Тонкий мазок» маркируют в толстой части (не следует делать надпись вдоль всего мазка).

6.4.4. Фиксация «тонких мазков»

1. Фиксацию мазков проводят: в этиловом спирте 96% — 10 мин или в смеси Никифорова — 20 мин.

2. Мазки погружают и извлекают из фиксирующей жидкости пинцетом.
Препараты по окончании фиксации высушивают на воздухе.

Препарат «толстая капля» не фиксируют!

При длительном хранении (особенно в жарком климате) неокрашенных «толстых капель» может произойти их аутофиксация. При необходимости хранения «толстых капель» для предотвращения аутофиксации препараты до окраски следует обработать забуференным раствором метиленового синего (1 г метиленового синего + 3 г NaHPO + 1 г KHPO + 300 мл дистиллированной воды). «Толстую каплю» после высыхания погружают в этот раствор на 1 секунду, промывают водой и высушивают. В таком виде каплю можно хранить длительное время. Перед исследованием окрашивают по Романовскому меньше, чем обычное время — в течение 6-10 минут.

6.5. Окраска препаратов крови

Одним из основных условий правильной паразитологической диагностики малярии является качественная окраска препаратов крови.

6.5.1. Приготовление рабочего раствора краски Романовского-Гимза

Для окрашивания препаратов крови используется 5% или 10% водный рабочий раствор краски Романовского-Гимза.

1. Маточный раствор краски Романовского-Гимза (промышленного изготовления или приготовленный из сухой краски) перемешать и обязательно профильтровать.

3. Готовый рабочий раствор перемешать.

4. При необходимости ускорения получения ответа можно использовать 20%-ный раствор, сократив время окраски до 15-20 мин.

Рабочий раствор для окраски препаратов крови использовать только свежеприготовленный!

Качество каждой новой серии краски необходимо оценить. С этой целью производят пробную окраску препаратов «тонкого мазка» и «толстой капли» крови от здорового человека (если нет крови с малярийными паразитами). Концентрацию рабочего раствора и время окрашивания можно подобрать самостоятельно, т.к. они зависят от качества исходного раствора краски и от температуры окружающей среды.
Показатели качественного окрашивания. Правильно окрашенный препарат макроскопически имеет синий цвет с сиреневым оттенком, а при его микроскопии:
ядра лейкоцитов фиолетово-красного цвета с различимой структурой;
зернистость базофилов фиолетового цвета;
зернистость эозинофилов красного цвета;
у моноцитов на фоне серо-голубой цитоплазмы может быть розовая зернистость;
зрелые эритроциты — розового цвета с сероватым оттенком;
ретикулоциты — сиренево-голубые;
тромбоциты — сиренево-розового цвета с различимой сетчатостью.
Иногда в промышленных сериях маточного раствора краски Романовского недостаточно азура, что обусловливает слабое окрашивание азурофильных элементов (ядер малярийных паразитов и лейкоцитов, зернистости пораженных эритроцитов и лейкоцитов). Результаты окрашивания мазков и капель могут быть значительно улучшены при добавлении к рабочему раствору краски Романовского так называемой синьки Мансона, которую готовят впрок следующим образом: 1,5 г метиленового синего и 2,5 г буры растирают в ступке и добавляют к 100 мл дистиллированной воды. Для созревания флакон с краской оставляют на 10-12 дней при комнатной температуре. Процесс созревания можно ускорить, поместив флакон на водяную баню на 40-60 мин при 60-80°.

Раствор не кипятить!

Синька Мансона при хранении в темном сухом месте пригодна к использованию в течение многих лет. Количество краски Мансона, добавляемое к рабочему раствору краски Романовского, устанавливают опытным путем: нередко достаточно добавить к 1 л рабочего раствора несколько капель краски.

6.5.2. Способы окрашивания и промывки «тонкого мазка» и «толстой капли » по Романовскому-Гимза

Окрашивание препаратов крови можно проводить двумя способами.

Оставить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *